Fachtóirí cur isteach ar imoibrithe PCR

Le linn imoibriú PCR, is minic a aimsítear roinnt fachtóirí cur isteach.
Mar gheall ar íogaireacht an-ard PCR, meastar go bhfuil éilliú ar cheann de na fachtóirí is tábhachtaí a dhéanann difear do thorthaí PCR agus is féidir torthaí dearfacha bréagacha a tháirgeadh.
Chomh tábhachtach céanna tá na foinsí éagsúla as a dtagann torthaí bréagacha diúltacha. Má chuirtear bac nó cur isteach ar chuid riachtanach amháin nó níos mó den mheascán PCR nó den imoibriú aimpliúcháin féin, is féidir bac a chur ar an measúnú diagnóiseach. Is féidir éifeachtúlacht laghdaithe agus fiú torthaí diúltacha bréagacha a bheith mar thoradh air seo.
Chomh maith le cosc, d’fhéadfadh go gcaillfí sláine an aigéid núicléigh sprice de bharr coinníollacha loingseoireachta agus/nó stórála roimh ullmhú an tsampla. Go háirithe, d'fhéadfadh damáiste do chealla agus d'aigéid núicléacha a bheith mar thoradh ar theocht ard nó stóráil neamhleor. Is eol go bhfuil fosúchán cille agus fíocháin agus neadú pairifín ina gcúiseanna aitheanta le hilroinnt DNA agus fadhb leanúnach (féach Fíoracha 1 agus 2). Sna cásanna seo, ní chuideoidh fiú aonrú agus íonú is fearr.

Fíor 1 | Éifeacht díluailithe ar shláine DNA
Léirigh leictreafóiréis glóthach agarose go raibh éagsúlacht mhór i gcáilíocht an DNA scoite amach ó chodanna paraifín d'uathopsies. Bhí DNA de mheánfhad difriúil blúirí i láthair sna sleachta ag brath ar an modh socraithe. Níor caomhnaíodh DNA ach amháin nuair a bhí sé socraithe i samplaí dúchasacha reoite agus i bhformailin neodrach maolánach. Mar thoradh ar dhéadchíora Bouin atá láidir aigéadach nó formalin neamh-mhaolaithe, ina bhfuil aigéad formach, cailleadh suntasach DNA. Tá an codán atá fágtha an-ilroinnte.
Ar an taobh clé, cuirtear fad na blúirí in iúl i mbeirteanna kilobase (kbp)

Fíor 2 | Cailliúint sláine spriocanna aigéid núicléacha
(a) Mar thoradh ar bhearna 3′-5′ ar an dá shnáithe beidh briseadh sa sprioc-DNA. tarlóidh sintéis DNA fós ar an mbroinn bheag. Mar sin féin, má tá suíomh anáil primer in easnamh ar an blúire DNA, ní tharlaíonn ach aimpliú líneach. Sa chás is fabhraí, féadfaidh na blúirí a chéile a athshuíomh, ach beidh an táirgeacht beag agus faoi bhun na leibhéil braite.
(b) Laghdaítear líon na mbannaí H agus laghdú ar Tm mar thoradh ar chailliúint bonn, go príomha mar gheall ar ídiú agus foirmiú dimer thymidine. Le linn na céime téimh fadaithe, leáfaidh na primers ón DNA maitrís agus ní dhéanfaidh siad anáil fiú faoi choinníollacha níos déine.
(c) Cruthaíonn bunanna tímín in aice láimhe diméir TT.
Fadhb choitianta eile a tharlaíonn go minic i ndiagnóisic mhóilíneach ná scaoileadh níos lú ná optamach de sprioc-aigéid núicléacha i gcomparáid le heastóscadh feanól-clóraform. I gcásanna tromchúiseacha, is féidir é seo a bheith bainteach le claonchlónna bréagacha. Is féidir go leor ama a shábháil trí lysis fiuchphointe nó díleá einsímeach de bhruscar cille, ach is minic a bhíonn íogaireacht íseal PCR mar thoradh ar an modh seo mar gheall ar scaoileadh neamhleor aigéad núicléach.

Cosc ar ghníomhaíocht pholaiméiráis le linn aimplithe

Go ginearálta, úsáidtear cosc ​​mar choincheap coimeádáin chun cur síos a dhéanamh ar na fachtóirí go léir as a dtagann torthaí PCR suboptimal. Sa chiall go docht bithcheimiceach, tá cosc ​​ar ghníomhaíocht na heinsíme teoranta, ie, laghdaíonn sé nó cuireann sé cosc ​​​​ar chomhshó foshraithe-táirgí trí idirghníomhú le suíomh gníomhach an DNA polymerase nó a cofactor (m.sh., Mg2+ do Taq DNA polymerase).
Is féidir le comhpháirteanna sa sampla nó maoláin agus eastóscáin éagsúla ina bhfuil imoibrithe bac díreach a chur ar an einsím nó a comhfhachtóirí a ghabháil (m.sh. EDTA), agus ar an gcaoi sin an polaiméaráis a dhíghníomhachtú agus torthaí PCR laghdaithe nó bréagacha diúltacha a bheith mar thoradh air.
Mar sin féin, sainítear go leor idirghníomhaíochtaí idir comhpháirteanna imoibrithe agus aigéid núicléacha a bhfuil spriocanna iontu mar 'choisctheoirí PCR' freisin. Nuair a chuirtear isteach ar shláine na cille trí leithlisiú agus go scaoiltear an t-aigéad núicléach, is féidir idirghníomhaíochtaí a bheith ann idir an sampla agus an tuaslagán mórthimpeall air agus an chéim sholadach. Mar shampla, is féidir le ‘scavengers’ DNA aonshnáithe nó snáithe dúbailte a cheangal trí idirghníomhaíochtaí neamhchomhfhiúsacha agus cur isteach ar leithlisiú agus íonú trí líon na spriocanna a shroicheann an soitheach imoibrithe PCR a laghdú sa deireadh.
Go ginearálta, tá coscairí PCR i láthair i bhformhór na sreabhán coirp agus imoibrithe a úsáidtear le haghaidh tástálacha diagnóiseacha cliniciúla (úiré i bhfual, haemaglóibin agus heparin san fhuil), forlíontaí aiste bia (comhpháirteanna orgánacha, glycogen, saill, iain Ca2+) agus comhpháirteanna sa chomhshaol (feinóil , miotal trom)

Is féidir coscairí PCR níos forleithne a fháil i mbaictéar agus i gcealla eucaryotic, DNA neamh-sprioc, macramóilíní maitrísí fíocháin atá ceangailteach le DNA agus trealamh saotharlainne ar nós lámhainní agus plaistigh. Is é íonú aigéid núicléacha le linn eastóscadh nó dá éis an modh is fearr chun coscairí PCR a bhaint.
Sa lá atá inniu ann, is féidir le trealamh éagsúla asbhainte uathoibrithe go leor prótacail láimhe a athsholáthar, ach níor baineadh amach 100% aisghabháil agus/nó íonú spriocanna riamh. D’fhéadfadh coscairí féideartha a bheith fós sna haigéid núicléacha íonaithe nó d’fhéadfadh go mbeadh éifeacht acu cheana féin. Tá straitéisí éagsúla ann chun tionchar na gcosc a laghdú. Is féidir le rogha an pholaiméiráis chuí tionchar suntasach a bheith aige ar ghníomhaíocht inhibitor. Tá modhanna cruthaithe eile chun cosc ​​PCR a laghdú ag méadú tiúchan polymerase nó ag cur breiseáin mar BSA i bhfeidhm.
Is féidir cosc ​​ar imoibrithe PCR a léiriú trí úsáid a bhaint as rialú cáilíochta próisis inmheánaigh (IPC).
Ní mór cúram a ghlacadh gach imoibrí agus tuaslagán eile sa trealamh eastósctha, mar shampla eatánól, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol agus feanól, a leithlisiú aigéad núicléach trí chéim níocháin críochnúil. Ag brath ar a dtiúchan, féadfaidh siad PCR a ghníomhachtú nó a chosc.