Fachtóirí trasnaíochta i bhfrithghníomhartha PCR

Le linn an imoibrithe PCR, is minic a bhíonn roinnt fachtóirí cur isteach orthu.
Mar gheall ar íogaireacht an -ard PCR, meastar go bhfuil éilliú ar cheann de na tosca is tábhachtaí a théann i bhfeidhm ar thorthaí PCR agus is féidir leis torthaí dearfacha bréagacha a chruthú.
Tá na foinsí éagsúla a mbíonn torthaí bréagacha diúltacha mar thoradh orthu. Má chuirtear bac nó cur isteach ar chuid amháin nó níos mó den mheascán PCR nó an t -imoibriú aimplithe féin, is féidir bac a chur ar an measúnacht dhiagnóiseach. D'fhéadfadh éifeachtúlacht laghdaithe agus torthaí diúltacha bréagacha a bheith mar thoradh air seo.
Chomh maith le toirmeasc, d'fhéadfadh cailliúint sláine aigéid núicléasaigh sprice tarlú mar gheall ar dhálaí loingseoireachta agus/nó stórála sula n -ullmhaítear sampla. Go háirithe, d'fhéadfadh go mbeadh damáiste do chealla agus d'aigéid núicléasacha mar thoradh ar theochtaí arda nó ar stóráil neamhleor. Is cúiseanna aitheanta iad fosúchán cealla agus fíochán agus leabú pairifín maidir le hilroinnt DNA agus fadhb leanúnach (féach Figiúirí 1 agus 2). Sna cásanna seo, ní chabhróidh fiú an t -aonrú agus an íonú is fearr is féidir leat.

Figiúr 1 | Éifeacht díluailithe ar shláine DNA
Léirigh leictreafóiréis ghlóthach agarose go raibh éagsúlacht mhór ag baint le cáilíocht an DNA a bhí scoite amach ó chodanna pairifín na n -autopsies. Bhí DNA de mheán -fhaid dhifriúla i láthair sna sleachta ag brath ar an modh fosúcháin. Níor caomhnaíodh DNA ach amháin nuair a socraíodh iad i samplaí reoite dúchasacha agus i bhfoirmín neodrach neodrach. Mar thoradh ar úsáid foirmiúil bouin aigéadach nó neamhshuimithe, cruthaíodh aigéad formach ina raibh aigéad formach cailliúint DNA suntasach. Tá an codán atá fágtha an -ilroinnte.
Ar an taobh clé, cuirtear fad na mbreiseán in iúl i bpéirí cileagram (KBP)

Fíor 2 | Cailliúint sláine spriocanna aigéid núicléasaigh
(a) Beidh sos sa sprioc DNA mar thoradh ar bhearna 3′-5 ′ ar an dá shnáithe. Tarlóidh sintéis DNA fós ar an mbloc beag. Mar sin féin, má tá suíomh anála primer ar iarraidh ar an mbloc DNA, ní tharlaíonn ach aimpliú líneach. Sa chás is fabhraí, d'fhéadfadh na blúirí a chéile a athsheoladh, ach beidh na torthaí beag agus faoi bhun na leibhéil braite.
. Le linn na céime téamh fadaithe, beidh na primers ag leá ar shiúl ón DNA maitríse agus ní bheidh siad ag cur isteach ar fiú coinníollacha nach bhfuil chomh dian.
(c) Cruthaíonn boinn thymine in aice láimhe dimer TT.
Fadhb choitianta eile a tharlaíonn go minic i ndiagnóisic mhóilíneach is ea an scaoileadh atá níos lú ná mar is fearr is féidir d'aigéid núicléasacha i gcomparáid le eastóscadh feanóil-chloroform. I gcásanna tromchúiseacha, is féidir é seo a bheith bainteach le claonchlónna bréagacha. Is féidir go leor ama a shábháil trí lysis fiuchta nó díleá einsímeach smionagar cille, ach is minic a bhíonn íogaireacht íseal PCR mar thoradh ar an modh seo mar gheall ar scaoileadh neamhleor aigéid núicléasaigh.

Toirmeasc ar ghníomhaíocht polaiméaráise le linn aimplithe

Go ginearálta, úsáidtear toirmeasc mar choincheap coimeádáin chun cur síos a dhéanamh ar na tosca go léir as a leanann torthaí PCR fo -optamach. I gciall atá go hiomlán bithcheimiceach, tá toirmeasc teoranta do ghníomhaíocht na heinsíme, ie, laghdaíonn sé nó cuireann sé cosc ​​ar chomhshó táirgí foshraithe trí idirghníomhaíocht le suíomh gníomhach an pholaiméar DNA nó a chófraí ​​(EG, Mg2+ le haghaidh polaiméaráise DNA).
Is féidir le comhpháirteanna sa sampla nó i maoláin agus i sleachta éagsúla ina bhfuil imoibrithe bac a chur ar an einsím go díreach nó a chuid cónraí a ghabháil (m.sh.
Mar sin féin, ainmnítear go leor idirghníomhaíochtaí idir comhpháirteanna imoibriúcháin agus aigéid núicléasacha spriocdhírithe mar 'choscairí PCR' freisin. Nuair a chuirtear isteach ar shláine na cille le haonrú agus go scaoiltear an t -aigéad núicléasach, is féidir le hidirghníomhaíochtaí idir an sampla agus a réiteach máguaird agus a chéim sholadach tarlú. Mar shampla, is féidir le 'Scavengers' ceangal a dhéanamh le DNA aon-shnáithe nó dúbailte trí idirghníomhaíochtaí neamh-chomhfhiúsacha agus cur isteach ar leithlisiú agus íonú trí líon na spriocanna a shroicheann an soitheach imoibriú PCR a laghdú.
Go ginearálta, tá coscairí PCR i láthair i bhformhór na sreabhán coirp agus na n -imoibrithe a úsáidtear le haghaidh tástálacha diagnóiseacha cliniciúla (urea i bhfual, haemaglóibin agus heparin i bhfuil), forlíontaí aiste bia (comhpháirteanna orgánacha, glycogen, saill, ian CA2+) agus comhpháirteanna sa chomhshaol (feinóil, miotal trom)

Is féidir coscairí PCR níos forleithne a fháil i mbaictéir agus i gcealla eukaryotic, DNA neamh-spriocdhírithe, macramóilíní DNA-ceangailteach de mhaitrísí fíochán agus trealamh saotharlainne amhail lámhainní agus plaistigh. Is é íonú aigéid núicléasacha le linn eastósctha nó tar éis an modh is fearr chun coscairí PCR a bhaint.
Sa lá atá inniu ann, is féidir le trealamh eastósctha uathoibrithe éagsúla ionad go leor prótacal láimhe a athsholáthar, ach níor baineadh amach aisghabháil 100% agus/nó íonú spriocanna riamh. D'fhéadfadh coscairí féideartha a bheith i láthair fós sna haigéid núicléasacha íonaithe nó d'fhéadfadh go mbeadh éifeacht acu cheana féin. Tá straitéisí éagsúla ann chun tionchar na gcoscairí a laghdú. Is féidir le rogha na polaiméaráise cuí tionchar suntasach a imirt ar ghníomhaíocht inhibitor. Is iad na modhanna cruthaithe eile chun toirmeasc PCR a laghdú ná tiúchan polaiméaráise a mhéadú nó breiseáin a chur i bhfeidhm mar BSA.
Is féidir toirmeasc ar imoibrithe PCR a léiriú trí rialú cáilíochta próisis inmheánaigh (IPC) a úsáid.
Ní mór a bheith cúramach chun gach imoibrí agus réiteach eile a bhaint sa trealamh eastósctha, mar eatánól, EDTA, Cetab, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol agus feanól, ón aigéad núicléasach a dhéanann céim níocháin críochnúil a leithlisiú. Ag brath ar a dtiúchan, féadfaidh siad PCR a ghníomhachtú nó a chosc.