Fachtóirí cur isteach in imoibrithe PCR

Le linn imoibriú PCR, is minic a bhíonn roinnt fachtóirí cur isteach le feiceáil.
Mar gheall ar íogaireacht an-ard PCR, meastar gurb é an éilliú ceann de na fachtóirí is tábhachtaí a théann i bhfeidhm ar thorthaí PCR agus is féidir leis torthaí dearfacha bréagacha a thabhairt.
Tá na foinsí éagsúla a mbíonn torthaí bréag-dhiúltacha mar thoradh orthu chomh ríthábhachtach céanna. Má chuirtear bac ar chuid amháin nó níos mó de na codanna riachtanacha den mheascán PCR nó den imoibriú aimplithe féin, nó má chuirtear isteach orthu, is féidir bac a chur ar an anailís dhiagnóiseach. Is féidir leis seo éifeachtúlacht laghdaithe agus fiú torthaí bréag-dhiúltacha a bheith mar thoradh air.
Chomh maith le cosc, d’fhéadfadh cailliúint sláine aigéid núicléasaigh sprice tarlú mar gheall ar dhálaí loingseoireachta agus/nó stórála roimh ullmhú an tsampla. Go háirithe, d’fhéadfadh teochtaí arda nó stóráil neamhleor damáiste a dhéanamh do chealla agus d’aigéid núicléasaigh. Is cúiseanna aitheanta le hilroinnt DNA agus is fadhb leanúnach iad socrú cealla agus fíocháin agus leabú paraifín (féach Fíor 1 agus 2). Sna cásanna seo, ní chabhróidh fiú an leithlisiú agus an íonú is fearr.

Fíor 1 | Éifeacht an neamhghluaiseachta ar shláine an DNA
Léirigh leictreafóiréis glóthach agaróise go raibh éagsúlacht mhór i gcáilíocht an DNA a leithlisíodh ó chodanna paraifín d’obráideanna. Bhí DNA de fhaid blúire éagsúla ar an meán i láthair sna sleachta ag brath ar an modh socraithe. Níor caomhnaíodh DNA ach amháin nuair a socraíodh é i samplaí reoite dúchasacha agus i formailin neodrach maolaithe. Mar thoradh ar úsáid socraitheora Bouin láidir aigéadach nó formailin neamh-mhaolaithe ina raibh aigéad formach, cailliúint shuntasach DNA. Tá an codán atá fágtha an-ilroinnte.
Ar chlé, léirítear fad na blúirí i mbeirteanna cileabháis (kbp)

Fíor 2 | Cailliúint sláine spriocanna aigéid núicléasaigh
(a) Má bhíonn bearna 3′-5′ ar an dá shnáithe, beidh briseadh sa DNA sprice. Tarlóidh sintéis DNA fós ar an blúire beag. Mar sin féin, mura bhfuil suíomh annála tosaithe ar an blúire DNA, ní tharlaíonn ach aimpliú líneach. Sa chás is fabhraí, féadfaidh na blúirí a chéile a athsháithiú, ach beidh na torthaí beag agus faoi bhun na leibhéal braite.
(b) Mar thoradh ar chailliúint bonn, den chuid is mó mar gheall ar dhíphúiríniú agus foirmiú démhéir thímidíne, laghdaítear líon na nasc H agus laghdaítear Tm. Le linn na céime téimh fadaithe, leáfaidh na tosaitheoirí ón DNA maitrís agus ní dhéanfaidh siad anneal fiú faoi choinníollacha nach bhfuil chomh dian.
(c) Cruthaíonn bunanna tímíne cóngaracha démhéir TT.
Fadhb choitianta eile a tharlaíonn go minic i ndiagnóisic mhóilíneach is ea scaoileadh neamh-optamach aigéid núicléasaigh sprice i gcomparáid le heastóscadh feinil-clóraform. I gcásanna foircneacha, is féidir é seo a bheith bainteach le diúltacha bréagacha. Is féidir go leor ama a shábháil trí lióis fhiuchta nó trí dhíleá einsímeach smionagar cille, ach is minic a bhíonn íogaireacht íseal PCR mar thoradh ar an modh seo mar gheall ar scaoileadh neamhleor aigéid núicléasaigh.

Cosc ar ghníomhaíocht polaiméaráise le linn aimplithe

Go ginearálta, úsáidtear cosc ​​mar choincheap coimeádáin chun cur síos a dhéanamh ar na fachtóirí uile a mbíonn torthaí PCR neamh-optamacha mar thoradh orthu. I gciall bithcheimiceach go docht, tá cosc ​​teoranta do ghníomhaíocht an einsíme, i.e., laghdaíonn sé nó cuireann sé cosc ​​ar chomhshó foshraith-táirge trí idirghníomhú le suíomh gníomhach an pholaiméaráise DNA nó a chomhfhachtóir (m.sh., Mg2+ le haghaidh polaiméaráise DNA Taq).
Is féidir le comhpháirteanna sa sampla nó i maoláin agus i sleachta éagsúla ina bhfuil imoibrithe an einsím a chosc go díreach nó a chomhfhachtóirí (m.sh. EDTA) a ghabháil, rud a dhíghníomhachtaíonn an polaiméaráis agus a fhágann go laghdaítear torthaí PCR nó go mbíonn siad bréagach diúltach.
Mar sin féin, tugtar 'coscairí PCR' ar go leor idirghníomhaíochtaí idir comhpháirteanna imoibrithe agus aigéid núicléacha ina bhfuil sprioc freisin. Nuair a chuirtear isteach ar shláine na cille trí leithlisiú agus nuair a scaoiltear an t-aigéad núicléach, is féidir idirghníomhaíochtaí idir an sampla agus a thuaslagán agus a chéim sholadach máguaird a tharlú. Mar shampla, is féidir le 'scabhálaithe' DNA aon-shnáithe nó dé-shnáithe a cheangal trí idirghníomhaíochtaí neamh-chomhfhiúsacha agus cur isteach ar leithlisiú agus íonú trí líon na spriocanna a shroicheann an soitheach imoibrithe PCR sa deireadh a laghdú.
Go ginearálta, bíonn coscairí PCR i láthair i bhformhór na sreabhán coirp agus na n-imoibrithe a úsáidtear le haghaidh tástálacha diagnóiseacha cliniciúla (úiré san fhual, haemaglóibin agus heipirín san fhuil), forlíontaí aiste bia (comhpháirteanna orgánacha, gliogóin, saill, iain Ca2+) agus comhpháirteanna sa chomhshaol (feinóil, miotail throma).

Is féidir coscairí PCR níos coitianta a fháil i mbaictéir agus i gcealla eocarótacha, i DNA neamhspriocdhírithe, i macramóilíní ceangailteach DNA i maitrísí fíocháin agus i dtrealamh saotharlainne amhail lámhainní agus plaistigh. Is é íonú aigéid núicléasacha le linn nó tar éis eastósctha an modh is fearr chun coscairí PCR a bhaint.
Sa lá atá inniu ann, is féidir le trealamh eastósctha uathoibrithe éagsúil go leor prótacal láimhe a athsholáthar, ach níor baineadh amach aisghabháil 100% agus/nó íonú spriocanna riamh. D’fhéadfadh coscairí féideartha a bheith i láthair fós sna haigéid núicléasacha íonaithe nó d’fhéadfadh siad a bheith i bhfeidhm cheana féin. Tá straitéisí éagsúla ann chun tionchar na gcoscairí a laghdú. Is féidir le rogha an pholaiméaráise chuí tionchar suntasach a imirt ar ghníomhaíocht an choscóra. Is iad modhanna cruthaithe eile chun cosc ​​PCR a laghdú ná tiúchan polaiméaráise a mhéadú nó breiseáin amhail BSA a chur i bhfeidhm.
Is féidir cosc ​​ar imoibrithe PCR a léiriú trí úsáid a bhaint as rialú cáilíochta próisis inmheánaigh (IPC).
Ní mór a bheith cúramach agus na himoibrithe agus na tuaslagáin eile go léir sa trealamh eastósctha, amhail eatánól, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol agus feinól, a bhaint as an aigéad núicléasach leithlisithe trí chéim níocháin críochnúil. Ag brath ar a dtiúchan, féadfaidh siad PCR a ghníomhachtú nó a chosc.